图1：摇床内部的设置：将摇瓶放置在杯

     在这项研究中，已经建立了摇瓶规模的反馈控制缩小模型。使用集成在摇瓶中的化学光学传感器（PSt3型）测量酿酒酵母培养物中的溶解氧（DO）浓度。溶解氧水平触发了按需碳进料。这种设置允许在摇瓶中进行自动补料分批培养，并提高在此规模下获得的数据质量，而不会影响结果的数量。摇瓶培养中的不同菌株与生物反应器规模表现出相同的排名。在***个实验中，在反馈控制系统中测试了DO-stat和碳限制过程。结果表明，采用该装置，该过程可以在摇瓶规模下成功进行。

   图2：酿酒酵母在按需喂养摇瓶设置中的培养。

   图3：四种酿酒酵母菌株在摇晃片尺度（蓝色）和生物反应器量表（红色）下的比较：细胞干重（顶部），产物浓度（中）和相对生产参数Ypx（底部）。

   图4：DO-Stat：碳限制过程;DO设定值 20 %。

   在用于生产***、蛋白质或营养添加剂的生物工艺开发中，在测试合适的细胞系、培养基组成和工艺条件时，使用缩小模型来节省时间和成本。然而，通常很难确定小规模工艺放大的关键参数。摇瓶通常用于生物技术研究和生产。它们代表了昂贵的大规模生物反应器系统的低成本替代品，并且更容易处理。另一方面，没有建立在线监测和控制这种规模的重要培养参数的系统。需要一种可靠的自动进料方法和消除手动取样，以改善摇瓶规模的生物工艺开发。在这些实验中，测试了可用于摇瓶培养的反馈控制系统。培养物中的溶解氧含量触发碳源饲料，PreSens使用化学光学传感器技术在线测量。氧传感器集成在玻璃锥形瓶的底部，并通过透明烧瓶壁非侵入性地读取。传感器信号被传输到 OXY-10 mini，这是一款 10 通道氧计，可在多达 10 个摇瓶中同时在线测量。使用蠕动泵，根据需要自动将葡萄糖溶液添加到培养物中。在酿酒酵母培养物中按需使用脉冲饲料进行测试，并将结果与生物反应器规模（20 L）获得的值进行比较。此外，该系统还用于测试碳限制过程，用于提高生物质和产品产量，其中DO试图保持在20%左右。

材料与方法

      在 工作体积为100 mL的500 mL玻璃摇瓶中进行实验，在2.5 cm投掷时摇晃速率为<250 rpm，或在5.0 cm投掷时<200 rpm。每个烧瓶的底部都有一个氧传感器点，并放置在Coaster CFG的顶部。杯垫是一种附件，可以将传感器信号传输到氧气计。OXY-10 mini通过RS232连接到Lantronix S2E转换器，该转换器连接到AdamBus A / D转换器。AdamBus A/D-转换器控制蠕动泵进行进料。一台带有Lucullus PIMS的PC用于从Lantronix S2E转换器收集数据并监控过程。每个摇瓶连接到带有硅胶或药用管（直径12 - 16管）的单个蠕动泵，允许0 - 50 g / h的流量。将试管连接到摇瓶盖上（见图1）。实际进料速率是通过流量与泵速的相关性计算的。首先，在8个摇瓶中对四种不同的酿酒酵母菌株进行实验，一式两份。根据需要将500 g / L葡萄糖溶液作为碳源以0.5小时的脉冲以20 g / h的进料速率给予培养物。进给速率和脉冲时间是经验值。当ΔDO/10分钟>10%时触发进料启动。在***个实验中，酿酒酵母试图在碳限制过程中保持在静态DO。使用150 g/L葡萄糖溶液，当ΔDO/10 min>10 %时再次触发进料启动。使用简单的两步控制器将溶解氧保持在20%的设定值，增量为0.5%。

结果

     按需馈送实验运行96小时（见图2）。在***阶段，初始葡萄糖被消耗，并且由于酿酒酵母的双氧生长部分转化为乙醇。细胞的生长导致溶解氧水平降低，并且在大约22小时（DO信号中的小峰）葡萄糖耗尽并且乙醇继续生长。由于摇瓶的氧气转移能力有限，DO水平在40小时左右达到零。当乙醇也耗尽时，培养基中不存在其他碳源，导致细胞对氧的吸收减少，因此溶解氧水平升高。这种增加被用作葡萄糖添加的触发因素。一旦再次消耗添加的葡萄糖和产生的乙醇，就开始下一个添加物。将摇瓶设置中四种酿酒酵母菌株的干重和产量与在生物反应器规模（20 L）下相同菌株获得的结果进行比较，结果发现摇瓶培养物的细胞干重和产物浓度达到较低的输出（图3），这是由生物反应器的较高氧转移容量引起的。然而，所有菌株在两个栽培规模上都表现出相同的排名，这使得能够挑选具有特殊特征的菌株用于以后的放大过程。相对生产参数的比较显示，摇瓶培养值与生物反应器规模的培养值具有良好的一致性（图3）。在***个实验中，自动摇瓶系统在具有静态DO的碳限制培养中进行了测试。 图4显示自动饲喂系统可用于进行DO-Stat培养。当溶解氧水平低于设定值时，进给速率降低，反之亦然。所选参数（0.5%进给速率增量，1小时步进时间）已经产生了非常好的溶氧控制。使用定义的工艺条件进行进一步微调可以降低溶解氧信号的振荡。

结论

     开发的用于摇瓶培养的按需饲喂系统显示出良好的效果，与生物反应器规模的值进行比较，可以得出结论，可以在此规模下比较和挑选不同的菌株。此外，在此设置中进行的测试非常节省时间。在生物反应器规模下只能运行 2 或 3 个实验的情况下，该系统允许每周进行 8 - 10 次测试。即使在碳限制过程中，系统也取得了意想不到的良好结果。在缩小比例过程中进行实验时，能够与PreSens OXY-10 mini同时在线和在多个摇瓶中测量溶解氧是一个重要优势。SFR 摇瓶读数仪允许在多达 9 个摇瓶中测量氧气和 pH 值，进一步实验可能会增强这种自动化且部分可控的摇瓶秤系统。已经计划进一步开发设置